Syn Franciszka, rzeźbiarza i fotografika, i Marii z Rogowskich. Matka zmarła, kiedy Stanisław Wyspiański miał siedem lat, a ponieważ ojciec nie potrafił sprawować nad nim odpowiedniej opieki, od 1880 roku wychowywał się u bezdzietnego wujostwa, Kazimierza i Joanny (Janiny) Stankiewiczów, którzy traktowali go jak własne dziecko. Stankiewiczowie byli ludźmi wysokiej kultury, w ich domu bywali m.in. Jan Matejko, Józef Szujski, Karol Estreicher i Władysław Łuszczkiewicz. Wyspiański kształcił się w mającym wielowiekowe tradycje gimnazjum św. Anny w Krakowie, gdzie wykłady odbywały się w języku polskim, a dużą uwagę przywiązywano do nauki historii Polski i historii literatury polskiej. Przez 8 lat nauki niczym się nie wyróżnił. W okresie szkolnym podjął pierwsze znane dziś próby literackie (interpretacja dramatyczna obrazu Matejki Batory pod Pskowem w roku 1886) oraz malarskie.
W czasie pobytu w szkole nawiązał koleżeńskie stosunki z Józefem Mehofferem, Lucjanem Rydlem, Stanisławem Estreicherem, Henrykiem Opieńskim i Jerzym Żuławskim.
W 1887 roku, po złożeniu egzaminów maturalnych, Wyspiański zapisał się na wydział filozoficzny Uniwersytetu Jagiellońskiego, gdzie w latach 1887–1890 i 1896–1897 uczęszczał na wykłady z historii, historii sztuki i literatury, i rozpoczął studia malarskie w Szkole Sztuk Pięknych w Krakowie, której dyrektorem był w tym czasie Jan Matejko. Jako wyróżniającemu się uczniowi Matejko powierzył mu współudział w wykonaniu zaprojektowanej przez siebie polichromii w odnawianym kościele Mariackim.
W roku 1890 artysta udał się w podróż zagraniczną po Europie – jej trasa wiodła przez Włochy i Szwajcarię do Francji (gdzie zgłębiał sztukę średniowieczną, głównie katedr gotyckich)[3], a dalej do Niemiec i Pragi. W latach 1891–1894 trzykrotnie przebywał w Paryżu, uczył się w prywatnej Academie Colarrosi i wiele malował. Żył wówczas w trudnych warunkach materialnych, korzystając ze stypendium Szkoły Sztuk Pięknych. W tym czasie zetknął się z Władysławem Ślewińskim, z Gauguinem i nabistami; silne wrażenie wywarło na nim malarstwo Pierre’a Puvisa de Chavannes, a zwłaszcza freski w Panteonie.
W tym czasie stale malował, jednocześnie jednak jego uwagę coraz bardziej przyciągał teatr. Uczęszczał na spektakle operowe, oglądał przedstawienia klasyków francuskich, interesował się tragedią antyczną i dramatami Szekspira. Powstały wówczas próby własnych dramatów Wyspiańskiego: Królowa Polskiej Korony i wstępne redakcje Legendy, Warszawianki, Daniela i Meleagra. Utwory artysta kończył już w Krakowie, dokąd wrócił na stałe w sierpniu 1894 roku.
Pod koniec lat 90. XIX wieku artysta odegrał istotną rolę w ruchu modernistycznym. Zaprojektował i częściowo wykonał polichromię w restaurowanym kościele Franciszkanów złożoną z motywów kwiatowych, heraldycznych i geometrycznych oraz witraże: bł. Salomei i św. Franciszka oraz Boga Ojca zatytułowany Stań się. Zdobył Nagrodę Polskiej Akademii Umiejętności za pejzaże z kopcem Kościuszki.
Jako malarz i dekorator nawiązał współpracę z Teatrem Miejskim w Krakowie pod dyrekcją Tadeusza Pawlikowskiego. Wkrótce na jego scenie rozwinął swoją twórczość dramatyczną.
W Krakowie Wyspiański był jednym z założycieli Towarzystwa Artystów Polskich „Sztuka” (1897), a w połowie 1898 objął stanowisko kierownika artystycznego tygodnika literacko-artystycznego „Życie”, redaktorem naczelnym którego był w tym czasie Stanisław Przybyszewski.
Jednak ani ogłoszenie drukiem Legendy (1897), ani pierwsze dzieła malarskie nie przyniosły Wyspiańskiemu większego uznania. Podobnie bez echa minęło wydanie Meleagra (1898). Dopiero wydanie Warszawianki zyskało mu szerszy rozgłos (wydanie w Życiu w roku 1898, a osobno w 1901) – dziełem tym Wyspiański zapoczątkował serię dramatów narodowych. W roku 1899 ukazały się dramaty Protesilas i Laodamia, Klątwa i Lelewel, a w roku 1900 Legion.
W roku 1900 Wyspiański poślubił chłopkę Teodorę Teofilę Pytko, mającą nieślubnego syna Teodora, przysposobionego przez artystę. Jeszcze przed ślubem urodziła się ich córka Helena (1895–1971) i syn Mieczysław (1899–1920), a później Stanisław (1901–1967).
W listopadzie 1900 wziął udział w weselu swego przyjaciela Lucjana Rydla w Bronowicach Małych. Na kanwie tego wydarzenia powstało słynne Wesele wydane w roku 1901, które przyniosło Wyspiańskiemu sławę i uznanie.
W roku 1903 artysta wydał trzy nowe dzieła: Wyzwolenie, Achileis i Bolesław Śmiały. W następnym roku ukazało się nowe opracowanie Legendy (tzw. Legenda II), Noc listopadowa oraz Akropolis. W latach następnych Wyspiański zajmował się dokończeniem utworów dawniej rozpoczętych i pracą nad nowymi. W roku 1907 ukazały się Skałka, Powrót Odysa oraz Sędziowie i przeróbka Cyda Corneille’a, pośmiertnie w 1910 tłumaczenie Zairy Woltera.
W roku 1906 Wyspiański został profesorem krakowskiej Akademii Sztuk Pięknych, był także członkiem krakowskiej Rady Miejskiej.
W ostatnim okresie życia schorowany i niedomagający fizycznie artysta leczył się w Rymanowie i Bad Hall, a potem przeniósł się do swojej chaty we wsi Węgrzce. Wyspiański chorował przez wiele lat i zmarł na nieuleczalną wówczas kiłę.
Pogrzeb Wyspiańskiego w Krakowie w 1907 roku stał się manifestacją narodową. Pochowany został w Krypcie Zasłużonych na Skałce.